熒光定量PCR（qPCR）介紹
實時熒光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR,，qPCR)，它是指在PCR反應體系中加入熒光基團,，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程,，最后通過標準曲線對初始模板進行定量分析的方法。該技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,，它的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)PCR不能對初始模板定量分析的問題,。熒光定量PCR具有準確性高、靈敏度高,、特異性強等優(yōu)點,，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領域,。
熒光定量PCR（qPCR）原理
在PCR反應體系中加入熒光基團，隨著PCR反應的進行,，PCR反應產(chǎn)物不斷累積,，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)收集一個熒光強度信號,，通過熒光強度變化檢測產(chǎn)物量的變化,，最終得到得到一條熒光擴增曲線圖，擴增曲線橫坐標表示循環(huán)數(shù),，縱坐標表示熒光強度,。
如圖所示 ：
圖1：qPCR擴增曲線
一般而言，熒光擴增曲線可以分為三個階段：熒光背景信號階段（基線期）,、熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期,。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,，無法判斷產(chǎn)物量的變化,；在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關系,，根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量也不能計算出起始DNA拷貝數(shù)；只有在熒光信號指數(shù)擴增階段,，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系,。
熒光定量PCR常用術語
在了解熒光定量PCR如何對初始模板進行定量之前，需要了解幾個在熒光定量PCR分析中常用的術語：
- 基線：實時熒光定量PCR反應的基線是指在PCR的最初幾個循環(huán)中（一般為3-15個循環(huán)）的信號水平,。此階段的熒光信號變化量極小,。低水平的基線信號相當于反應的背景或噪聲。每個實時熒光定量PCR反應的基線應通過用戶分析或擴增曲線自動分析,，根據(jù)經(jīng)驗確定,。基線的設置,，會影響到熒光閾值及Ct值,。
- 熒光閾值：熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上,，一般熒光閾值默認是PCR 3-15個循環(huán)熒光信號標準偏差的10倍,。
- Ct值：Ct值指的是PCR擴增過程中擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)。
- 標準曲線：標準曲線是標準物質(zhì)的物理/化學屬性跟儀器響應之間的函數(shù)關系,。對已知拷貝數(shù)的標準樣品做系列稀釋,，對不同稀釋度的標準樣品進行熒光定量PCR并記錄Ct值，根據(jù)Ct值及拷貝數(shù)的對數(shù)繪制得到標準曲線，標準曲線的縱坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),，橫坐標代Ct值,。
如何實現(xiàn)對初始模板的定量
利用實時熒光定量PCR對樣品的初始模板量進行定量分析，需要利用已知起始拷貝數(shù)的標準品作出標準曲線,，再通過熒光定量PCR獲得未知樣品的Ct值,，最后從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
圖2：對初始模板進行定量分析
標準曲線繪制
標準品的制備:
設計特定引物,，利用PCR對目的基因片段進行擴增,，隨后將目的基因片段克隆至載體中，測序驗證是否為陽性重組質(zhì)粒,，最后收集陽性克隆質(zhì)粒作為標準品,。
繪制標準曲線:測定質(zhì)粒的濃度，依據(jù)公式計算出質(zhì)粒的拷貝數(shù),。對質(zhì)粒進行系列稀釋,，分別作為模板進行熒光定量PCR并記錄Ct值。最后依據(jù)起始拷貝數(shù)的對數(shù)及Ct值繪制標準曲線,，得到標準方程,。當需要對起始模板進行定量時，只需要得到擴增曲線,，讀得Ct值,，帶入標準方程即可對起始模板定量。
熒光標記方法
實時熒光定量PCR熒光標記方法可分為熒光染料法和熒光探針法兩類,。染料法是利用熒光染料可以嵌合到DNA雙鏈內(nèi)部的特性,，來指示擴增產(chǎn)物的增加。而探針法是利用與靶序列特異結合的熒光探針的信號積累來指示擴增產(chǎn)物的增加,。
熒光染料：染料法是利用熒光染料可以嵌合到DNA雙鏈內(nèi)部的特性,，來指示擴增產(chǎn)物的增加。現(xiàn)以最常用的SYBR GreenⅠ為例,，介紹染料法熒光定量PCR的工作原理：
圖3：熒光染料法原理
SYBR GreenⅠ是一種熒光染料,，可嵌合到雙鏈DNA的內(nèi)部。在游離狀態(tài)下,，SYBR Green Ⅰ發(fā)出微弱的熒光,，但一旦與雙鏈DNA結合，其熒光增加1000倍,。一個反應發(fā)出的全部熒光信號與出現(xiàn)的雙鏈DNA量呈正比,，隨擴增產(chǎn)物的增加而增加，可通過熒光信號的積累來指示擴增產(chǎn)物的增加,。
熒光探針：探針為一段寡核苷酸，可與DNA序列特異性結合,，一個模板結合一個探針,。探針5'端具有報告基團（R）,，可發(fā)光；3'端有熒光淬滅基團（Q）,，能吸收光,。探針完整時R基團所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，PCR儀檢測不到熒光信號,。隨著擴增的進行,，探針會被聚合酶水解，報告基團發(fā)出的光沒有被淬滅基團吸收,，從而被儀器檢測到,。每擴增一條DNA鏈，釋放一個熒光信號,，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步,。
圖4：探針原理
探針法與染料法對比
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探針法 |
染料法 |
優(yōu)點 |
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1.對DNA模板沒有選擇性，適用于任何DNA
2.使用方便,，不必設計復雜探針
3.成本低
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缺點 |
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1.容易與非特異性雙鏈DNA結合,，產(chǎn)生假陽性
2.對引物特異性要求高
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