熒光定量PCR（qPCR）介紹
實時熒光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR,，qPCR)，它是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對初始模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,，它的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)PCR不能對初始模板定量分析的問題,。熒光定量PCR具有準(zhǔn)確性高、靈敏度高,、特異性強(qiáng)等優(yōu)點,，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。
熒光定量PCR（qPCR）原理
在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加,。每經(jīng)過一個循環(huán)收集一個熒光強(qiáng)度信號,，通過熒光強(qiáng)度變化檢測產(chǎn)物量的變化，最終得到得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖,，擴(kuò)增曲線橫坐標(biāo)表示循環(huán)數(shù),，縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度,。
如圖所示 ：
圖1：qPCR擴(kuò)增曲線
一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分為三個階段：熒光背景信號階段（基線期）,、熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期,。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,，無法判斷產(chǎn)物量的變化,；在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,，根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量也不能計算出起始DNA拷貝數(shù)；只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段,，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,。
熒光定量PCR常用術(shù)語
在了解熒光定量PCR如何對初始模板進(jìn)行定量之前，需要了解幾個在熒光定量PCR分析中常用的術(shù)語：
- 基線：實時熒光定量PCR反應(yīng)的基線是指在PCR的最初幾個循環(huán)中（一般為3-15個循環(huán)）的信號水平,。此階段的熒光信號變化量極小,。低水平的基線信號相當(dāng)于反應(yīng)的背景或噪聲。每個實時熒光定量PCR反應(yīng)的基線應(yīng)通過用戶分析或擴(kuò)增曲線自動分析,，根據(jù)經(jīng)驗確定,。基線的設(shè)置,，會影響到熒光閾值及Ct值,。
- 熒光閾值：熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,，一般熒光閾值默認(rèn)是PCR 3-15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,。
- Ct值：Ct值指的是PCR擴(kuò)增過程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)。
- 標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的物理/化學(xué)屬性跟儀器響應(yīng)之間的函數(shù)關(guān)系,。對已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品做系列稀釋,，對不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行熒光定量PCR并記錄Ct值，根據(jù)Ct值及拷貝數(shù)的對數(shù)繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,，標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),，橫坐標(biāo)代Ct值,。
如何實現(xiàn)對初始模板的定量
利用實時熒光定量PCR對樣品的初始模板量進(jìn)行定量分析,，需要利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過熒光定量PCR獲得未知樣品的Ct值,，最后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù),。
圖2：對初始模板進(jìn)行定量分析
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
標(biāo)準(zhǔn)品的制備:
設(shè)計特定引物，利用PCR對目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,，隨后將目的基因片段克隆至載體中,，測序驗證是否為陽性重組質(zhì)粒,，最后收集陽性克隆質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:測定質(zhì)粒的濃度,，依據(jù)公式計算出質(zhì)粒的拷貝數(shù),。對質(zhì)粒進(jìn)行系列稀釋，分別作為模板進(jìn)行熒光定量PCR并記錄Ct值,。最后依據(jù)起始拷貝數(shù)的對數(shù)及Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，得到標(biāo)準(zhǔn)方程。當(dāng)需要對起始模板進(jìn)行定量時,，只需要得到擴(kuò)增曲線,，讀得Ct值，帶入標(biāo)準(zhǔn)方程即可對起始模板定量,。
熒光標(biāo)記方法
實時熒光定量PCR熒光標(biāo)記方法可分為熒光染料法和熒光探針法兩類,。染料法是利用熒光染料可以嵌合到DNA雙鏈內(nèi)部的特性，來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加,。而探針法是利用與靶序列特異結(jié)合的熒光探針的信號積累來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加,。
熒光染料：染料法是利用熒光染料可以嵌合到DNA雙鏈內(nèi)部的特性，來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加�,，F(xiàn)以最常用的SYBR GreenⅠ為例,，介紹染料法熒光定量PCR的工作原理：
圖3：熒光染料法原理
SYBR GreenⅠ是一種熒光染料，可嵌合到雙鏈DNA的內(nèi)部,。在游離狀態(tài)下,，SYBR Green Ⅰ發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合,，其熒光增加1000倍,。一個反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號與出現(xiàn)的雙鏈DNA量呈正比，隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加,，可通過熒光信號的積累來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加,。
熒光探針：探針為一段寡核苷酸，可與DNA序列特異性結(jié)合,，一個模板結(jié)合一個探針,。探針5'端具有報告基團(tuán)（R），可發(fā)光,；3'端有熒光淬滅基團(tuán)（Q）,，能吸收光。探針完整時R基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收,，PCR儀檢測不到熒光信號,。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，探針會被聚合酶水解,，報告基團(tuán)發(fā)出的光沒有被淬滅基團(tuán)吸收,，從而被儀器檢測到,。每擴(kuò)增一條DNA鏈，釋放一個熒光信號,，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步,。
圖4：探針原理
探針法與染料法對比
|
探針法 |
染料法 |
優(yōu)點 |
|
1.對DNA模板沒有選擇性，適用于任何DNA
2.使用方便,，不必設(shè)計復(fù)雜探針
3.成本低
|
缺點 |
1.只適合一個特定的目標(biāo)
2.探針價格較高
|
1.容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合,，產(chǎn)生假陽性
2.對引物特異性要求高
|
|
