熒光定量PCR結(jié)果分析
一般而言,，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期,。在熒光背景信號階段,，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,，無法判斷產(chǎn)物量的變化;在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級增加,，PCR終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,，無法計(jì)算起始模板拷貝數(shù)。因此只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段,，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,，故選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量方便,，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)中引入了幾個(gè)重要的概念：擴(kuò)增曲線,、熒光閾值、CT值,。
(1)擴(kuò)增曲線
圖1：qPCR擴(kuò)增曲線
注：
橫坐標(biāo)：代表擴(kuò)增循環(huán)數(shù);
縱坐標(biāo)：代表熒光強(qiáng)度,，每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號收集。
(2)熒光閾值(Threshold)
在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值,，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,，但一般熒光閾值的設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個(gè)循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。
(3)CT值
每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),。每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多,，Ct值越小,。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),，縱坐標(biāo)代表Ct值,。因此，只要獲得未知樣品的Ct值,，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù),。同時(shí)，對于熒光PCR實(shí)驗(yàn)來說,，CT值也是判讀樣品陰陽性的重要指標(biāo),。
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