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對于做分子實(shí)驗(yàn)的人來說，探針引物，一個(gè)很熟悉的詞語,，科研人員也會經(jīng)常用到,，但是對于探針引物的設(shè)計(jì)，您知道多少,？今天,，我們就簡單的談下這種引物的設(shè)計(jì)。
通用原則
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先選擇好探針,，然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近于探針,；
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擴(kuò)增子的長度應(yīng)不超過400bp，理想的最好能在100－150bp內(nèi),，擴(kuò)增片斷越短,，有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容易獲得，較短的擴(kuò)增片斷也容易保證分析的一致性,；
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保持GC含量在20％和80％之間,，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低,，及在SG分析中非特異信號,；
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為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列,，尤其是G（不能有4個(gè)連續(xù)的G）,；
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將引物和探針互相進(jìn)行配對檢測，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成,。
探針設(shè)計(jì)指導(dǎo)
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在設(shè)計(jì)引物之前設(shè)計(jì)探針,；
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探針的Tm值應(yīng)在68－70℃之間，如果是目測探針,，則要仔細(xì)審查GC富含區(qū),；
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探針的5'端要避免有鳥氨酸，5'G會有淬滅作用,，即使被切割下來這種淬滅作用也還會存在,；
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選擇C多于G的鏈作探針，G的含量多于C會降低反應(yīng)效率,，這時(shí)就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針,；
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探針應(yīng)盡可能的短，不要超過30個(gè)bp,；
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檢測探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu),。
引物設(shè)計(jì)指導(dǎo)
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引物的Tm值應(yīng)在58－60℃之間，這非常重要,，因?yàn)槲覀兊脑囼?yàn)一般都使用退火溫度為60℃,，在這個(gè)溫度下,，5'核酸外切酶的活性最高；
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引物末端（最后5個(gè)核苷酸）不能有超過2個(gè)的G和C,；
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將引物盡量接近于探針,。循環(huán)參數(shù)當(dāng)引物和探針按照上述原則設(shè)計(jì)好后，循環(huán)的參數(shù)也就確定了,，當(dāng)經(jīng)過起始的變性溫度后(根據(jù)Tag酶要求設(shè)定),，反應(yīng)要經(jīng)過95℃，15－20秒,，60℃,，60秒，對于一些模板,，45秒也足夠了,，數(shù)據(jù)在退火時(shí)檢測。
優(yōu)化探針和引物的濃度
對于雙探針反應(yīng),，通過選擇探針和引物的濃度來優(yōu)化反應(yīng)結(jié)果,，能獲得最低的CT值，以及相對于背景來說熒光值有最高的增長,。引物濃度應(yīng)該在50nM-900nM 范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化,，探針濃度應(yīng)該在50－250nM范圍內(nèi)優(yōu)。
探針的濃度應(yīng)該從（50,，100,，250nM）與引物濃度相組合，在Rotor-Gene上進(jìn)行試驗(yàn),，選擇最小CT值和最高反應(yīng)擴(kuò)增的曲線做后續(xù)試驗(yàn),。
通常所用的探針和引物濃度分別為250nM 和900nM,，絕大多數(shù)反應(yīng)都可以在這個(gè)濃度下進(jìn)行,，但為了尋找****的濃度,，還是應(yīng)該依照上述的步驟,。由于引物溶解溫度預(yù)測的差異和多種探針設(shè)計(jì)程序，因此使用三種退火溫度（58℃,，60℃,，62℃）對優(yōu)化是很有用的,。
引物的濃度也會影響溶解溫度,，高的引物濃度會讓溶解溫度提高2度左右,。Primer3是個(gè)非常有用的軟件，但它不能避免3'端的G,，所以應(yīng)將3'端的G去除，并觀察探針的退火溫度是否比引物高8－10度,。
定量數(shù)據(jù)的分析
分析定量數(shù)據(jù)主要有兩種基本的方法：絕對定量和相對定量,。研究人員應(yīng)該根據(jù)擴(kuò)增子和試驗(yàn)?zāi)康膩頉Q定如何分析定量數(shù)據(jù)。
（1）絕對定量
絕對定量是將未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較進(jìn)行分析，一般標(biāo)準(zhǔn)品就是一個(gè)已知絕對濃度的DNA樣品,，關(guān)于何種標(biāo)準(zhǔn)品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線一直有很多討論,，理想的標(biāo)準(zhǔn)品其擴(kuò)增方式應(yīng)該是與待測樣品一致得，然而這往往是不可能的,。一些人會克隆他們得目的基因,，并與未知樣品比較。要注意得是,，絕對定量分析的準(zhǔn)確性是依靠標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確性得,。
在Rotro-Gene 上可以用幾種方法來分析絕對定量數(shù)據(jù)。包括標(biāo)準(zhǔn)曲線在內(nèi)的R值,，反應(yīng)效率都會被呈現(xiàn)出來,。也可以從以外的分析中調(diào)用標(biāo)準(zhǔn)曲線并讓它與一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品相調(diào)整，（或重復(fù)相同的標(biāo)準(zhǔn)品）,，這個(gè)功能在確定斜率的重復(fù)性好與Y截距的基礎(chǔ)上完成,。對一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線來說，一個(gè)單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)品就已經(jīng)足夠了,，也可以在不同的通道甚至一個(gè)通道內(nèi)繪制多條標(biāo)準(zhǔn)曲線,。
（2）相對定量
相對定量是指兩個(gè)或更多的基因互相進(jìn)行比較，其結(jié)果是一個(gè)比率,，沒有確切的數(shù)字被檢測道,。一種檢測基因表達(dá)相對定量的方法叫"比較CT值法（⊿⊿Ct）"，這種方法可以徹底不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線,，通過觀察與一個(gè)動態(tài)相關(guān)對sPCR照比較的表達(dá)水平,，從而可以將模板與增加的樣品間進(jìn)行相對定量。要使這種方法成功,，目的及參照的動態(tài)范圍應(yīng)該相類似,。
相對的一個(gè)敏感的方法就是看⊿Ct（相同的起始模板濃度，兩個(gè)擴(kuò)增子的兩個(gè)CT值的差異）隨著不同稀釋度的模板有什么變化,。如果兩個(gè)擴(kuò)增子的反應(yīng)效率大致相同,，則the plot of log input amount versus ⊿Ct 將是一條水平線（斜率<0.01）。這意味著在初始模板濃度范圍內(nèi),，兩個(gè)擴(kuò)增子有相同的反應(yīng)效率,。如果檢測發(fā)現(xiàn)效率不一致，則應(yīng)該用標(biāo)準(zhǔn)曲線來對基因表達(dá)進(jìn)行定量,，或優(yōu)化反應(yīng)獲得一個(gè)類似的效率,。
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