熒光定量PCR（qPCR）就是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。由于常規(guī)的PCR的缺點，
熒光定量PCR（ qPCR）由于其操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點發(fā)展非常迅速。設(shè)在已經(jīng)涉及到生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，比如基因的差異表達分析，SNP檢測，等位基因的檢測，藥物開發(fā)，臨床診斷，轉(zhuǎn)基因研究等。
我想做過
熒光定量PCR（qPCR）的研究者用過的儀器也無怪乎ABI 7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlus TM、StepOne TM、PRISM? StepOne TM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5?、MyiQ?、MJ Research Chromo4 TM Opticon系列；Stratagene Mx TM系列；Roche LightCycler?系列；Eppendorf Masercycler?；Corbett Rotor-Gene TM；Cepheid SmartCycler? 和BIOER 的LineGene系列。其儀器的設(shè)置和數(shù)據(jù)輸出方式基本類似，相差不大。
有過qPCR實驗經(jīng)驗的研究者可能很快就能熟悉其不同于PCR的結(jié)果Ct值，以及數(shù)據(jù)的常用運算方法比較Ct方法（2-△△Ct）。那么這個數(shù)據(jù)到底有沒有統(tǒng)計意義呢？這個該如何分析？我們來逐漸了解相對定量qPCR的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
首先在數(shù)據(jù)分析之前，要確保數(shù)據(jù)的準確性，也就是實驗過程的各個部門都要嚴格操作，也就是
MIQE標準（具體可見Bustin SA et al Clin Chem 55,611-622 2009）。這些都做到了，那么就可以來分析Ct數(shù)據(jù)了。
統(tǒng)計分析，至少有3個數(shù)據(jù)才可以。那就是在設(shè)計實驗中，每組至少要有3個生物學(xué)重復(fù)（也就是3個不同的樣本）。這個和qPCR的3個PCR replicate是完全不同的概念（這兒是同一個樣本的3個重復(fù)）。
下面我們就以一個處理分析的實驗來做說明如何來數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。1個處理組和1個對照組，每組有3個樣本（也就是生物學(xué)重復(fù)），來檢測某目的基因（target，設(shè)定內(nèi)參基因為reference），在這個處理中，目的基因的表達是否受到抑制？同時這個抑制作用是否有統(tǒng)計學(xué)意義。
不管是哪個qPCR儀，都可以做此檢測，數(shù)據(jù)也都可以用excel表歸納如下：
Group |
Sample |
Ct target |
Ct mean of T |
Ct reference |
Ct mean of R |
CON |
sample1 |
22.89 |
22.90 |
15.29 |
15.63 |
22.82 |
15.91 |
23.00 |
15.69 |
sample2 |
22.60 |
22.64 |
15.83 |
15.60 |
22.46 |
15.71 |
22.85 |
15.27 |
sample3 |
22.49 |
22.53 |
14.81 |
14.98 |
22.49 |
14.79 |
22.60 |
15.34 |
TRT |
sample1 |
25.32 |
25.31 |
14.98 |
15.18 |
25.40 |
15.33 |
25.20 |
15.22 |
sample2 |
25.70 |
25.60 |
15.46 |
15.38 |
25.50 |
15.45 |
25.61 |
15.22 |
sample3 |
25.49 |
25.60 |
15.25 |
15.05 |
25.68 |
14.6 |
25.64 |
15.29 |
首先每個樣品的目的基因和內(nèi)參基因的3個PCR replicate要求出平均值，這個僅僅是技術(shù)重復(fù)，也就是確定這個數(shù)據(jù)是可靠的。然后求出在每個樣品的目的基因的變化量也就是（目的基因的量和其對應(yīng)的內(nèi)參基因的量相比，也就是2-△Ct）。然后再平均對照組中的3個2-△Ct，在此例子中數(shù)據(jù)為0.006482，然后所有2-△Ct的都和0.006482相比即可到2-△△Ct，也就是倍數(shù)變化（fold change或者relative expression）。
下面就可以對2-△△Ct或者2-△Ct或者就行統(tǒng)計分析，Ct的2種形式都可以進行統(tǒng)計分析，唯獨不能對Ct進行統(tǒng)計分析。具體統(tǒng)計分析的方法，任何統(tǒng)計分析軟件都可以用比如SPSS，GraphPad等。這里展示一下GraphPad分析的結(jié)果。
Group |
Sample |
Ct target |
Ct mean of T |
Ct reference |
Ct mean of R |
2-△Ct |
2-△△Ct |
CON |
sample1 |
22.89 |
22.90 |
15.29 |
15.63 |
0.006464 |
0.99724 |
22.82 |
15.91 |
23.00 |
15.69 |
sample2 |
22.60 |
22.64 |
15.83 |
15.60 |
0.007634 |
1.17773 |
22.46 |
15.71 |
22.85 |
15.27 |
sample3 |
22.49 |
22.53 |
14.81 |
14.98 |
0.005348 |
0.82512 |
22.49 |
14.79 |
22.60 |
15.34 |
TRT |
sample1 |
25.32 |
25.31 |
14.98 |
15.18 |
0.000892 |
0.13768 |
25.40 |
15.33 |
25.20 |
15.22 |
sample2 |
25.70 |
25.60 |
15.46 |
15.38 |
0.000835 |
0.12875 |
25.50 |
15.45 |
25.61 |
15.22 |
sample3 |
25.49 |
25.60 |
15.25 |
15.05 |
0.000664 |
0.10243 |
25.68 |
14.6 |
25.64 |
15.29 |
相關(guān)連接：
熒光定量PCR
miRNA熒光定量PCR
lncRNA熒光定量PCR
circRNA熒光定量PCR
熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)專題
