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1.Western Blot檢測樣本要求
新鮮的樣品，組織（植物組織、動(dòng)物組織）、細(xì)胞，由信諾金達(dá)負(fù)責(zé)提取蛋白。
組織樣品：提供250-500mg新鮮樣品/樣；
細(xì)胞樣品：提供1×106～1×107細(xì)胞/樣；
以上樣品均需要干冰運(yùn)輸。
注：貼壁細(xì)胞的處理方法（冰上操作）
1) 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，細(xì)胞刮直接刮下來，PBS重懸清洗，吹洗后離心（5000 rpm，4min）去上清-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
2) 裂解液裂解，裂解后離心（12000 rpm，4min），取上清。
2.Western Blot檢測中為什么檢測無信號(hào)？（白板）
大概總結(jié)為一下幾類原因：
（1）樣品中目的蛋白豐度很低，低于實(shí)驗(yàn)的檢測下限
（2）一抗不識(shí)別檢測物種的蛋白，同時(shí)若有陽性參照的話提供陽性對(duì)照蛋白，若陽性對(duì)照正常則說明抗體及實(shí)驗(yàn)參照沒有問題，可能是樣本中目的蛋白含量比較低。
（3）蛋白降解
(4）待測樣品的確為陰性；
（5）一抗失效；
（6）抗原量不足，每泳道蛋白上樣量不低于0.1ug。
3.Western Blot檢測中為什么選擇內(nèi)參？
內(nèi)參也叫看家基因，在組織或細(xì)胞中都會(huì)表達(dá)，且表達(dá)量在不同組織或細(xì)胞中幾乎是相同的，一般有α-Tublin，β-actin，GAPDH等，在Western Blot中使用內(nèi)參其實(shí)就是在Western Blot過程中用內(nèi)參對(duì)應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參。
其作用有兩個(gè):
（1）看提取蛋白質(zhì)量的好壞。如果做western的時(shí)候，內(nèi)參蛋白有條帶，而目的蛋白沒有，說明蛋白的提取和轉(zhuǎn)膜等步驟沒有問題，是目的蛋白的抗體質(zhì)量不好或者是稀釋倍數(shù)不對(duì)。
（2）比較客觀的說明目的蛋白的表達(dá)情況，消除上樣量等的誤差。不同的樣品之間由于蛋白提取的量有差別，可能強(qiáng)陽性的表達(dá)跑出來的帶很弱。
因此設(shè)立內(nèi)參照，比較不同樣品之間的表達(dá)情況。
3.Western Blot檢測中為什么內(nèi)參條帶不一致？
這個(gè)是正常現(xiàn)象。理論上，目的蛋白在對(duì)應(yīng)總蛋白中的比例大致相同，內(nèi)參和目的蛋白的比例也在相應(yīng)組保持一致。同樣的，內(nèi)參不一致的時(shí)候，上樣總蛋白量相同，但目的蛋白（內(nèi)參蛋白）在不同樣品中提取后的內(nèi)參蛋白量不一定是完全一致的，所以在進(jìn)行Western Blot定量分析時(shí)會(huì)通過內(nèi)參進(jìn)行校正分析，最終獲得相對(duì)的表達(dá)量的分析結(jié)果。
4.Western Blot檢測中為什么檢測的結(jié)果分子量大小與實(shí)際不符？
（1）翻譯后修飾—比如蛋白的磷酸化，糖基化等，這些都會(huì)增加蛋白的分子量大小。
（2）翻譯后剪切—比如很多蛋白首先被合成為前體形式，然后通過剪切獲得生物學(xué)活性。
（3）剪接變異體—相同的基因，經(jīng)過選擇性剪接會(huì)產(chǎn)生不同分子量大小的蛋白。
（4）相對(duì)電荷—氨基酸的組成 (帶電 vs 不帶電)。
（5）多聚體—比如蛋白二聚體。
5.為什么檢測結(jié)果有很多雜帶？
(1)可能是樣品本身體內(nèi)表達(dá)的蛋白具有多種修飾形式如糖基化、磷酸化、乙酰化等；
(2)若是細(xì)胞樣品，可能是細(xì)胞傳代次數(shù)過多，使其蛋白表達(dá)不同，可以使用傳達(dá)次數(shù)少的進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)一起做對(duì)照看看；
(3)蛋白降解，導(dǎo)致蛋白分子量降低；
(4)蛋白形成多聚體形式。
6.為什么Western Blot檢測的背景比較高？
(1)可能抗體濃度較高；
(2)抗原量較大；
(3)一張膜中有的目的條帶較弱，為了能讓較弱條帶顯示出來，曝光時(shí)間較長。
7.為什么Western Blot的結(jié)果與QPCR結(jié)果趨勢不一樣？
這種情況是比較正常的， Western Blot反映的是蛋白水平的結(jié)果， qPCR反映的是基因水平的結(jié)果。理論上蛋白水平與基因水平是一致的，但是mRNA的高低不代表其表達(dá)蛋白的高低。
也有一些基因可能在組織樣品中沒有正常翻譯，這樣即使qPCR檢測結(jié)果有表達(dá)，但是若蛋白沒有正常翻譯的話，Western Blot則檢測不到目的條帶。
相關(guān)連接：
Western Blot檢測
熒光定量PCR檢測
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